影响免疫检测的因素有很多，包括缓冲液、封闭、抗体、清洗、检测底物等等。下面是yjbys小编为大家带来的影响免疫检测的因素的知识，欢迎阅读。
缓冲液
最常用的两种缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris缓冲液(TBS)。调整配方中缓冲液组分的各种改良配方已见诸期刊。缓冲液的关键要求是它应有助于保持抗体的生物活性。因此，离子强度和pH值应相当接近生理状态。PBS的配方(磷酸盐总浓度10mM)适用于广泛的抗体和检测底物。
在孵育过程中，装有膜的容器应轻轻摇动。缓冲液的量应足够，完全覆盖膜，使其在缓冲液中自由漂浮。如果不止一张印迹放在容器中，缓冲液容量不足会导致印迹膜粘在一起。这将影响孵育溶液的充分接触，导致各种假象，如背景高、信号弱和灵敏度不均匀等。
封闭
要获得有意义的结果，必须保证抗体只与感兴趣的蛋白质结合，而不与膜结合。利用惰性蛋白、非离子去污剂，或无蛋白的封闭剂来封闭膜上未被占据的位点，可减少抗体的非特异结合(NSB)。
封闭剂与膜的亲和力应高于抗体。它应填满膜上未被占据的位点，但不会替换膜上的目标蛋白。最常用的封闭剂是牛血清白蛋白(BSA，0.2-5.0%)、脱脂牛奶、酪蛋白、明胶、吐温20去污剂的稀释液(0.05-0.1%)以及Bløk®试剂。封闭剂通常溶解在PBS或TBS中。
与封闭相关的风险包括：选择不适当的封闭剂或过量封闭会替换或掩盖目标蛋白质。因此，封闭剂的正确选择对成功的免疫检测很关键。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白标记的抗体，因为牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特异性抗体对磷酸化蛋白进行检测分析时，如果采用粗蛋白制剂作为封闭剂，由于这些制剂中可能含有磷酸酶，而印迹上的磷酸化蛋白会被这些酶去磷酸化，就有可能会影响分析结果。研究表明，在封闭液中添加磷酸酶抑制剂可增强磷酸化特异性抗体的信号。此外，适用于一种抗原-抗体组合的封闭剂可能不适用于其他组合。
封闭液被点样在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸润，并在TBS中平衡。随后在印迹上添加检测试剂，孵育5分钟，并曝光在X射线胶片上。暗斑的'出现则表明封闭剂与检测试剂不兼容。如果在标准的Western印迹操作中用Immobilon®-P转印膜来替代Immobilon®-PSQ转印膜，那么封闭液可能不足以饱和膜表面。可能需要更多的清洗步骤来降低背景。
抗体
在封闭之后，印迹与一个或多个抗体孵育。第一个抗体与目标蛋白结合，而第二个抗体与第一个结合。第二个抗体结合有酶或染料，可用来指示蛋白的位置。
尽管一抗能直接标记，但使用二抗有明显的优势。首先，不止一个二抗分子能够与单个一抗分子结合，形成信号扩增。其次，标记的二抗(酶-抗体结合物)可用于大量不同特异性的一抗，从而不再需要标记多个一抗。
多克隆或单克隆的一抗都可使用。多克隆抗体通常是以抗血清或亲和纯化的抗体形式提供的。单克隆抗体是在腹水或组织培养液中表达的，可直接使用或进行亲和纯化。一定要记住，变性蛋白可能无法被天然抗原培育出的抗体所识别。在某些情况下，可能需要非变性凝胶来进行印迹。抗体以缓冲液和封闭液稀释，以避免与膜的非特异结合。抗体稀释液通常也包含痕量的吐温20或另一种去污剂，以防止抗体的非特异聚集。许多发表的化学发光操作需要在封闭液和抗体稀释液中添加0.1%(v/v)吐温20。我们必须认识到，高于0.05%(v/v)的浓度有可能从膜上洗掉一些印迹的蛋白质。
提高吐温20去污剂的浓度通常会降低背景。一种更简单且更经济的策略是降低抗体的浓度，特别是二抗(详见图1)。抗体必须特异针对目的蛋白，不能与封闭液中的组分交叉反应，且应该是相对纯净的。其他蛋白质或聚集物形式的杂质会导致非特异性结合和背景增高。
免疫检测是一种极其灵敏的方法。为了实现高的信噪比和最高的灵敏度，一抗和二抗的浓度应针对每种情况来优化。一般来说，高倍稀释一抗或降低凝胶上的蛋白上样量可减少非特异信号。高倍稀释酶标记的二抗可最大限度降低整体的高背景。
一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。高灵敏度的试剂(检测到飞克级)与低灵敏度的试剂(检测到皮克级)相比，抗体用量可减少20倍。抗体浓度的优化取决于检测底物的例子如图13所示。在使用最灵敏的检测试剂时，过量的抗体导致高的非特异性和整体背景增高(左上)。在这种情况下，将一抗稀释度从1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用没那么灵敏的检测试剂(中间和最下面一行)时，抗体需要更为浓缩，以产生相同的信号。
清洗
清洗印迹，从膜上去除未结合的抗体，它们可能导致高背景和检测不佳。通常使用吐温20的PBS或TBS稀释液(0.05% v/v)，特别是当抗体制剂是粗制的，或高浓度使用时。如前所述，浓缩的去污剂溶液可能导致感兴趣的蛋白质从膜上洗脱。对于高度纯化的抗体，往往只使用缓冲液进行清洗。
所需的清洗次数最好根据实验来确定。清洗太少会产生过多的背景，而清洗过度有可能洗脱抗体并降低信号。建议至少清洗三次，每次5分钟。
在TBS清洗液中添加最多0.5M NaCl和0.2% SDS，并将清洗时间延长至2小时，可降低顽固的背景。
