(1)软琼脂的配制：含有20%NCS(小牛血清)的.2倍浓缩的RPMI1640.
①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
(2)用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
(3)按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
(4)1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
(5)混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。
(6)4～5天 后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。
(7)检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。
